Le dicen BPA, pero no se trata de un apodo cariñoso. Resulta más cómodo que decirle bisfenol A o 4,4’-isopropilidendifenol. Pero se le llame como se le llame, lo cierto es que se trata de una sustancia química de amplio uso. Está presente en policarbonatos, resinas epoxi, poliéster y retardantes de llama. Pero hay un problema: también se lo usa en el envasado de alimentos, y el BPA anda en envases plásticos, botellas de agua o recubriendo latas, tapones y cañerías de agua. Y más aún: también se lo emplea en el papel térmico con el que hoy se emite la gran parte de los recibos en comercios y locales de pago, boletos de transporte y otros papeles que tocamos a diario. ¿Cuál es el problema de que el BPA esté en contacto con alimentos y recibos? Que es un producto tóxico. Pero además está considerado un disruptor endócrino: una sustancia química que, cuando ingresa al organismo, produce afectaciones hormonales.
Según los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos, en una evaluación reciente –de noviembre de 2014– la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) de ese país estableció que “el bisfenol A es seguro en los niveles actuales en los que se encuentra en los alimentos”. Pero a pesar de ello, recuerdan que “la FDA ya no aprueba el uso de bisfenol A en biberones, vasos para bebés y envases de fórmula para bebés”.
El BPA ingresa a nuestro organismo principalmente a través de la dieta. Pero dado que se absorbe también por la piel, se apunta además, aunque en menor medida, a la manipulación de los recibos térmicos. Según un estudio realizado en 2004 por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos, se encontraron rastros de BPA en 93% de 2.517 muestras de orina. Sí, por extraño o triste que suene, es altamente probable que usted y todas las personas que conozca carguen con algo de BPA.
Con el paso de los años, cada vez se acumula más evidencia acerca de los efectos perjudiciales del bisfenol A. Varios estudios llevados a cabo in vitro (en cultivos celulares) o con modelos animales in vivo (ratas, monos y otros) asocian al BPA con “trastornos reproductivos masculinos y femeninos” y con “la interrupción del desarrollo temprano de las gónadas”.
Si hacen un repaso a todo lo expuesto arriba, verán escritas siglas de instituciones de Estados Unidos. En una búsqueda online darán con datos de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria o alguna agencia similar. Por ese motivo es tan relevante la publicación del artículo “La exposición perinatal al Bisfenol A afecta la diferenciación temprana de las células germinales masculinas” por parte de investigadoras del Institut Pasteur de Montevideo, en colaboración con colegas del Instituto de Salud y Ambiente del Litoral de la Universidad Nacional del Litoral, de Santa Fe, Argentina.
Por un lado, el trabajo de nuestras científicas y sus colegas arroja resultados interesantes que aportan evidencia nueva y original acerca de los peligros que entraña el uso del BPA. Por otro, la investigación muestra que nuestra comunidad científica no sólo produce ciencia de calidad sobre temas de profundo interés mundial, sino que también contribuye con conocimiento para que, si quienes regulan la peligrosidad de las sustancias y los compuestos toman cartas, vivamos vidas más plenas.
Con la ayuda de ratones transgénicos
Mariela Bollati y Romina Pagotto, ambas de la Unidad de Biología Celular, se mueven por los corredores del Institut Pasteur de Montevideo con la misma facilidad que un ratón que conoce de memoria un laberinto. Están buscando, para la foto, a Martina Crispo, de la Unidad de Animales Transgénicos y de Experimentación, que también participó en los experimentos y la publicación del artículo.
Lo primero que quiero saber es cómo terminaron estudiando los efectos del BPA en los espermatozoides de ratones transgénicos. Y, como sucede a menudo en ciencia, el camino no es una línea recta. “El grupo del Instituto de Salud y Ambiente del Litoral tiene una tradición de estudiar perturbadores endócrinos. Y la primera vez que vino Horacio Rodríguez, que es nuestro colaborador y coautor de este trabajo, lo hizo porque quería estudiar ovarios de rata por citometría de flujo”, recuerda Bollati. El citómetro de flujo permite contar y separar distintos tipos de células que circulan en una suspensión. Y, a diferencia del microscopio, el citómetro de flujo puede contar miles de células por segundo. “Aquel contacto inicial no fue muy productivo, porque los ovarios tienen mucho tejido conectivo, lo que hace muy difícil disgregar para hacer la suspensión celular y estudiarlos en el citómetro”, añade Bollati.
Pero el contratiempo no evitó que siguieran pensando en el asunto. Entonces dieron con un paper acerca de unos ratones transgénicos que habían sido modificados para que un gen, el Oct4, expresara su proteína con fluorescencia verde (la técnica de la expresión de proteínas verdes fluorescentes, GFP por su sigla en inglés, le valió a Martin Chalfie el Premio Nobel de química en 2008). ¿Y por qué eran importantes estos ratones transgénicos? Porque el gen Oct4 se expresa más en las células germinales indiferenciadas, que son un tipo de células madre que al diferenciarse producen espermatozoides en los machos y óvulos en las hembras. En esa diferenciación que lleva a estas células a convertirse en espermatozoides, el gen Oct4 va reduciendo su actividad. “Entonces fácilmente, conforme esas células se van diferenciando, se observa que van perdiendo el verde, y por tanto es una manera de evaluar la maduración”, sostiene Bollati.
Según el refrán que se prefiera, el mundo puede ser ancho y ajeno o un pañuelo. En este caso resultó lo segundo: uno de quienes habían desarrollado esos ratones transgénicos Oct4 era Konstantinos Anastassiadis. “¡Había sido mi colega en un curso que dictamos durante mi posdoctorado en Alemania!”, dice Bollati. Así que le escribieron a la Universidad de Dresde y él aceptó gentilmente enviarles una colonia de esos ratones genéticamente modificados (“fueron un amable regalo del Dr. Anastassiadis”, dicen en el artículo).
Cuando la colonia de ratones transgénicos llegó se pusieron a trabajar en el modelo, lo que en forma breve implica poner a punto las técnicas de detección de esas proteínas verdes y determinar en qué momento era oportuno analizar a los ratones para ver ese proceso de diferenciación de las células germinales en su camino a convertirse en células que darían origen a espermatozoides. Eso fue motivo de la publicación de un artículo en 2015, llamado “Caracterización de un ratón transgénico Oct4-GFP como modelo de estudio del efecto de estrógenos ambientales en la maduración de células germinales masculinas usando citometría de flujo”. Es así que determinaron que medir la diferenciación de las células germinales al día siete de nacidos los ratones modificados rendiría sus frutos para establecer si un disruptor endócrino producía alteraciones. ¿Pero con qué químico que afecta a las hormonas hacer los experimentos?
“Elegimos someterlo al BPA porque era un tema de interés y justo por esa época, en 2012, había salido la prohibición de fabricar y comercializar mamaderas que contuvieran BPA”, dice Bollati, mostrando que el artículo publicado en 2020 no surge por generación espontánea, sino tras años de trabajo arduo. En efecto, en el decreto firmado el 21 de marzo de 2012 por el entonces ministro de Salud, Jorge Venegas, se resolvía prohibir “en todo el territorio nacional la fabricación, importación y comercialización de biberones de policarbonato que contengan en su composición Bisfenol A”. Se alegaba que “la información científica demuestra que la incorporación del compuesto denominado Bisfenol A (BPA), como monómero de partida y/o aditivo en los plásticos usados para la fabricación de biberones, es un riesgo innecesario para la salud de los lactantes”, y recordaba que tanto Brasil, en 2011, como Argentina, en marzo de ese mismo 2012, habían tomado la misma resolución.
Definidos el modelo de estudio y el disruptor endócrino, se preguntaron qué pasaría si sometieran a las hembras de ratón preñadas a los pocos días de formación del embrión hasta el séptimo día de nacidas las crías. “Con este proyecto nos propusimos enfocarnos en los períodos más sensibles dentro del desarrollo de las células germinales, que son durante la etapa embrionaria y la posnatal. Con este diseño, la madre está expuesta, el BPA pasaría a través de la placenta, y también a través de la lactancia”, explica Bollati. “Teníamos un lindo modelito para ver cómo el disruptor que estábamos incorporando se iba a traducir en la descendencia, y vimos resultados en el corto plazo, a los siete días, en una edad temprana para observar las células germinales más inmaduras, y en una edad más adulta cuando los machos comienzan su vida reproductiva”.
Pagotto, la primera autora del artículo, asiente y hace una puntualización. “En muchos estudios el objetivo final es ver qué pasa con el animal en su etapa reproductiva, si el adulto puede reproducirse o no, si el recuento de espermatozoides es normal o no. Nosotros agregamos ese extra que nos parecía importante al tratar de ver qué pasa antes de esa etapa reproductiva. Con este análisis a los siete días posnatales, y a través del uso de estas células germinales transgénicas, podríamos centrar nuestros estudios en esa etapa temprana del desarrollo”, explica apuntando a una de las más fascinantes e importantes contribuciones del trabajo. Si bien ya existían estudios sobre el efecto del BPA en la diferenciación de células germinales in vitro, y estudios in vivo en la etapa reproductiva de adultos, en esta investigación ambas cosas se dan al mismo tiempo: en animales vivos, observan el efecto en la diferenciación de estas células que luego darán lugar a los espermatozoides más adelante en la vida del individuo, así como qué pasa cuando esos mismos individuos llegan a su adultez reproductiva.
Madres expuestas...
En el artículo señalan que se ha demostrado que “existe una creciente evidencia científica que muestra que los testículos son objetivos de la acción del BPA en diferentes especies”, y reseñan que en ratones y ratas se ha visto que la exposición perinatal –en las etapas previas y posteriores al nacimiento– y en etapa adulta “afecta la producción y calidad de los espermatozoides de una manera nociva”. También dicen que se ha reportado el efecto del BPA “en las primeras etapas de la diferenciación de células germinales in vitro”, pero dejan constancia de que “el efecto de la exposición perinatal al BPA in vivo sobre la diferenciación temprana de las células germinales se ha investigado poco hasta ahora”. De hecho, este es el primer trabajo que reporta un experimento sobre el efecto del BPA en animales vivos en la diferenciación de las células germinales de los recién nacidos y, al mismo tiempo, de qué pasa con los espermatozoides cuando esos individuos son adultos. Como si eso fuera poco, también aporta la innovación de emplear citometría de flujo para observar esos procesos de diferenciación de las células germinales.
Para el experimento se dejó que hembras y machos de los ratones transgénicos se aparearan. Las hembras que quedaron preñadas –no ahondo más en el tema para preservar la vida íntima y sexual de las ratonas y los ratones– fueron separadas en tres grupos. A unas se les administraría por vía oral mediante sonda una dosis diaria de 50 microgramos de bisfenol A por kilogramo de peso desde el día quinto de gestación hasta los siete días de nacidas las crías. En otro grupo esa dosis subiría a 400 microgramos diarios de BPA por kilogramo de peso, mientras que al restante, que sería el grupo control, se le daría sólo etanol al 0,1%, que es el solvente usado para solubilizar el BPA, algo inocuo.
Las dosis de bisfenol A a las que se expusieron las madres gestantes y lactantes no fueron arbitrarias: en el artículo señalan que los 50 microgramos por kilo de peso por día se administraron debido a que “se ha referido como la dosis segura de BPA por vía oral”. La dosis mayor, la de 400 microgramos, en cambio, “se ha referido en estudios anteriores como la cantidad de BPA a la que deben exponerse hembras de monos Rhesus y ratones CD-1 no preñadas para alcanzar niveles circulantes de BPA similares a los medidos en humanos”. Reiteramos: “dosis segura” y “niveles circulantes de BPA similares a los medidos en humanos”. Bollati lo explica así: “Trabajamos con niveles bajos de BPA. No es que les pusimos una bomba para ver efectos”.
Las ratonas tuvieron camadas de varias crías, entre las que hubo cantidades similares de hembras y machos. Dado que estudiarían la diferenciación de las células germinales masculinas y los espermatozoides, para este trabajo sólo reportan las consecuencias del bisfenol A en la descendencia de machos. De todas formas, eso también era un resultado: el BPA no había alterado la relación entre crías hembras y machos, que fue igual en el grupo de control que en las crías de madres que recibieron el químico.
Un grupo de crías macho fue sacrificado al día siete de haber nacido y sus testículos fueron preparados para ser analizados tanto en el citómetro de flujo como para análisis moleculares e histológicos. El otro grupo de la camada de machos siguió con vida hasta el día 130, etapa en la que los ratones ya son reproductivamente adultos. Y esto es importante: los ratones que siguieron hasta la etapa adulta no fueron expuestos a más bisfenol A que el que recibieron a través de la gestación estando en el útero de sus madres o el que absorbieron en la leche materna hasta el día siete de nacidos. Si había un efecto del BPA en sus espermatozoides adultos, se debería sólo a aquella exposición temprana. En los adultos se analizó la calidad del esperma, la morfología testicular y la expresión de proteínas de receptores hormonales.
...testículos impactados
Al analizar los resultados, en el artículo informan respecto de las crías al día siete que “las suspensiones de células testiculares de machos nacidos de madres tratadas con ambas dosis de BPA mostraron un aumento en la intensidad de fluorescencia media para las células positivas a Oct4”. Como vimos, cuanto más fluorescencia, menos diferenciadas las células germinales o, si se quiere, menos maduras en su camino hacia las células que luego permitirán fabricar espermatozoides.
En el trabajo publicado entonces señalan que sus resultados “sugieren que los machos nacidos de madres expuestas perinatalmente al BPA tienen una mayor proporción de espermatogonias indiferenciadas que los machos no expuestos”. Las espermatogonias son justamente las células madre germinales que ya se diferenciaron para especializarse en la producción de espermatozoides. Menos células diferenciadas no es algo bueno, al menos cuando uno piensa en la reproducción. En otro pasaje nuestras investigadoras afirman que su investigación “agrega evidencia a la hipótesis de que el BPA podría modificar el estado madurativo en las células germinales”.
“Lo que vimos es que las crías de esas madres que fueron expuestas al BPA tienen un mayor grado de indiferenciación, mayor cantidad de células verdes, como que habría una especie de bloqueo”, resume Bollati. Pero la cuestión no termina allí: los ratones que llegaron a la adultez también presentaron afectaciones por la exposición de sus madres al BPA.
“Esto sería un llamado de atención sobre qué tan difícil es establecer cuáles son las consecuencias de una exposición puntual al BPA. Porque hay evidencia que apunta a que incluso ni siquiera se limitan a la descendencia directa”. Romina Pagotto
“La calidad de los espermatozoides, el recuento de espermatozoides, la movilidad y la viabilidad se analizaron en ratones machos adultos”, informan en la revista Reproductive Toxicology, para luego decir: “encontramos que el número de espermatozoides se redujo significativamente en los animales tratados con BPA50, sin diferencias en la movilidad o viabilidad”. ¡La exposición temprana, en un plazo acotado de tiempo, mientras estaban dentro de sus madres o lactando, había afectado la cantidad de espermatozoides de estos ratones cuando llegaron a la adultez! “Esto es un llamado de atención sobre qué tan difícil es establecer cuáles son las consecuencias de una exposición puntual al BPA. Porque hay evidencia que apunta a que esa consecuencia incluso ni siquiera se limita a la descendencia directa, sino que también puede estar afectando lo que pase con los hijos de los animales que fueron expuestos a través de la madre. Es increíble”, dice Pagotto.
Para hacer el tema de los límites seguros de BPA aún más complejo –recordemos que la dosis de 50 microgramos era considerada segura y la de 400 el nivel normal en sangre detectado en humanos–, la investigación arroja también un resultado que puede resultar desconcertante: si bien al día siete los ratones machos cuyas madres recibieron la mayor dosis de BPA tenían más intensidad de verde fluorescente –indicador de la indiferenciación de sus células germinales–, es decir que a mayor dosis mayor efecto, en el caso del conteo de espermatozoides en los adultos al día 130 quienes peores resultados obtuvieron fueron los ratones de madres expuestas a la dosis menor.
“Eso está relacionado con una característica que tienen muchos perturbadores endócrinos”, dice Bollati. “No hay un efecto lineal en las dosis, como sucede en algunas sustancias tóxicas, que a mayor concentración mayor toxicidad. En los perturbadores endócrinos hay veces que concentraciones bajas producen un efecto y concentraciones altas o no producen ese efecto o producen otro”, prosigue, y agrega que eso tiene que ver “con el accionar de las hormonas, donde pequeños cambios hormonales o pequeñas alteraciones ya te cambian toda la señalización”.
Espermatozoides y reproducción en problemas
“Nuestros resultados destacan una función de alteración temprana del BPA que podría afectar la reproducción masculina, reforzando la idea de que las gónadas son objetivos sensibles de los compuestos de disruptores endócrinos y agregando evidencia a la hipótesis de los disruptores endócrinos como causa de la reducción de la calidad del esperma en todo el mundo”, señalan en su artículo. Y no es para nada un tema menor.
“Hoy se acepta que a nivel global, si se comparan los recuentos de espermatozoides de hace 40 años con los de ahora, hay una baja. Lo que todavía no se sabe es por qué”, apunta Pagotto. “Desde nuestro punto de vista, por un lado tenemos que hay un aumento en la cantidad de perturbadores endócrinos que se están usando, y por otro están los datos de que el recuento espermático disminuye. Lo que nos falta todavía es encontrar un link más directo entre estos dos fenómenos, como para poder proponer que ambos están relacionados”, agrega. Les digo que sé que en ciencia no es bueno hacer afirmaciones demasiado categóricas, pero que sin embargo su investigación sí muestra que la administración de estas dosis de BPA en ratones durante la gestación y la lactancia se asoció con un menor conteo de espermatozoides. “Sí, y que fue consecuencia de la administración en ese período acotado, porque después los ratones no fueron expuestos a más al bisfenol A”, reconoce Pagotto.
Al leer el artículo, al ver el complicado diseño experimental que tuvieron que llevar adelante, uno se pregunta qué tipo de experimentos realizaron quienes afirman que 50 microgramos por día es una dosis segura. ¿Segura de qué manera? ¿En quiénes? ¿Durante cuánto tiempo? ¿En qué etapa de su historia de vida? ¿Tener menos espermatozoides varios años después es un indicador de que la dosis es segura? Les digo que algo maravilloso del trabajo es que deja más dudas que certezas. O la certeza de que no sabemos suficiente como para predecir qué efectos tendrán las distintas dosis de exposición al BPA.
“Creo que las agencias regulatorias deberían aplicar el principio de precaución”. Mariela Bollati
“Por lo que sé los estudios que determinan las dosis seguras juntan varios experimentos y tratan de unificarlos haciendo una especie de revisión. Pero el problema es que es poco probable que encuentren dos estudios que hagan exactamente lo mismo, con las mismas dosis e iguales formas de administración, por lo que resulta difícil sacar conclusiones”, dice Pagotto. “También está el tema de los modelos”, complementa Bollati, refiriéndose a que hay estudios con monos, ratas, ratones, etcétera. “Después está el tema de trasladar lo encontrado en esos modelos al ser humano o a las especies que están expuestas. Porque hay muchos perturbadores endócrinos que están en efluentes y afectan a otras especies, como por ejemplo peces”, complejiza aún más. Pero hay algo que tiene claro: “Para mí es preferible ser más precavido y cauto antes que esperar a juntar 80.000 evidencias para convencerte de qué dosis es la segura. Creo que las agencias regulatorias, por ejemplo la Enviromental Protection Agency, que es la que aconseja en Estados Unidos, o su par europea, deberían aplicar el principio de precaución”.
Cuidarnos más
El bisfenol A está en muchos plásticos de nuestra vida cotidiana. Y también en los recibos térmicos que hoy son más difíciles de evitar que hacer un comentario tonto en una red social. Recibos, tickets de pago, boletos. Hoy el BPA está en contacto con nuestras manos y piel. Y se ha demostrado que el bisfenol A se absorbe por vía dérmica. El trabajo confirma que el BPA tiene efectos disruptores endócrinos que afectan la reproducción. Y que la etapa de gestación y lactancia es muy sensible a su influencia.
“El embarazo, no sólo con relación al bisfenol A en particular y a los estrógenos en general, es un período de gran sensibilidad, porque allí todavía el individuo no tiene un sistema de metabolización de los compuestos, como tiene el adulto. Entonces tal vez reciban dosis más altas que los adultos porque no las pueden metabolizar. Y además en esa etapa se están llevando a cabo un montón de procesos que dependen de estas hormonas”, explica Pagotto.
“Sin entrar en la paranoia total, si uno pudiera de a poco tomar acciones preventivas y correctivas sería ideal”, dice Bollati. “Si se puede evitar el uso de este tipo de papel, si en lugar de estar usando envases de plástico, no sólo por el impacto ambiental, sino por este efecto de los perturbadores endócrinos y empleamos más vidrio, sería bueno. Lo mismo que esos termitos preciosos de metal, que por dentro están recubiertos de BPA, como algunas latas que tienen BPA porque no son de acero inoxidable. Hay que informar sobre estas cosas para que cada cual sea libre de tomar su decisión. También las agencias regulatorias tendrían que tener un rol más activo”, agrega. Y para eso evidencia de calidad, como la que acaban de publicar, es más que relevante.
“Yo creo que todas las medidas suman”, añade Pagotto. “Si al calentar la comida que tenés en un táper la sacás del recipiente y la ponés en un plato de cerámica o vidrio es mejor. Si lo podés hacer y no te cuesta nada, ¿por qué no hacerlo y disminuir el riesgo?”.
Para terminar, les digo que aquí hay un tema de género que podría ayudar. En el mundo tonto e injusto en que vivimos, tal vez demostrar que el BPA afecta al esperma, uno de los bastiones de la masculinidad, pueda tener más impacto que decir que afecta a los ovarios. No en vano en este siglo XXI aún se da por sentado que es mejor que las mujeres consuman hormonas para regular su ciclo de ovulación que desarrollar y hacer de uso extendido las pastillas anticonceptivas que actúen sobre los espermatozoides. Les propongo titular la nota con algo así como “Recibos térmicos, testículos fritos” o algo similar. ¿Tendrá más impacto en los tomadores de decisiones ir por este camino? “A mí me gustaría creer que no, que va a ser tan interesante hablar de efectos en ovarios como en espermatozoides”, dice Pagotto. A uno también. Pero, por las dudas, deja el título peleador. Como ella misma dijo: “Si lo podés hacer y no te cuesta nada, ¿por qué no hacerlo y disminuir el riesgo?”.
Artículo: “Perinatal exposure to Bisphenol A disturbs the early differentiation of male germ cells”
Publicación: Reproductive Toxicology (setiembre 2020)
Autores: Romina Pagotto, Clarisa Santamaría, María Harreguy, Julián Abud, María Laura Zenclussen, Laura Kass, Martina Crispo, Mónica Múñoz-de-Toro, Horacio Rodríguez, Mariela Bollati-Fogolín