Ciencia uruguaya destacada en Nature

La línea de investigación sobre ARN extracelular llevada adelante en el Institut Pasteur de Montevideo y la Universidad de la República fue motivo de una nota especial de la prestigiosa revista científica. Y tiene sentido: podría cambiar algunos paradigmas de la biología.

Supónganse que van andando por la ruta 5, pongamos que a la altura de Durazno, y ven un complejo edilicio que luce un letrero que explica que es una fábrica de cohetes espaciales y de material para asentar una colonia humana en Marte. Supónganse que están sentados junto a un río en una plácida tarde de sol cuando un pez brota del agua agitando lo que parecen ser unas alas y, efectivamente, vuela hasta la copa de un árbol, donde se queda un par de horas oteando el paisaje para luego volver al zambullirse. Supónganse que entran en una caverna en la que los objetos, como si fueran dólares en la pizarra de un cambio, nunca caen y flotan haciendo caso omiso al mandato de la gravedad. Bueno, algo así es lo que la revista Nature vio en el trabajo que investigadores e investigadoras de la Universidad de la República (Udelar) y el Institut Pasteur de Montevideo vienen haciendo en el área de los ARN extracelulares.

Lo que nuestros científicos encontraron parece ser algo tan imposible como una fábrica de materiales espaciales en la ruta 5, un pez con alas que vuele y respire horas fuera del agua o un lugar natural en el que la gravedad se anula. Están convencidos, y tienen pruebas, de que han encontrado ribosomas fuera de las células. Puede que esto no a todos les parezca insólito, pero recordemos que los ribosomas se conocen como las fábricas de proteínas de las células. Es en los ribosomas, que están dentro de las células, donde el ADN, que tiene la información genética, se une con el ARN, con suficiente energía para producir las proteínas, esas moléculas sin las cuales sería impensable la vida. Hasta ahora la existencia de estas fábricas de proteínas sólo era conocida dentro de las células, y su presencia fuera de ellas nos obligaría a salir corriendo a reescribir los textos de biología.

Azorada con la posibilidad, la revista Nature se puso en contacto con Juan Pablo Tosar, de la Unidad de Bioquímica Analítica del Centro de Investigaciones Nucleares de la Facultad de Ciencias y de la Unidad de Genómica Funcional del Institut Pasteur de Montevideo. La jugosa nota, firmada por Roxanne Khamsi, fue publicada el 18 de junio en un dosier especial dedicado al ARN extracelular, un campo de la ciencia muy activo en tiempos recientes. ¿Esto debe alegrarnos y llenarnos de orgullo? Definitivamente, sí. Porque muestra que nuestra comunidad científica, que localmente ha dejado en evidencia su valor ante este coronavirus, también es reconocida internacionalmente. Y porque además, al abordar un tema tan básico y universal como el funcionamiento de las células, también nos prueba que no hay temas que nuestra ciencia no deba abordar. La sed de conocimiento es universal y nuestros investigadores e investigadoras están a la altura.

Terminator y ARN fuera de las células

El ARN, el ácido ribonucleico, según dice el propio Tosar, es “el hermano no tan conocido del ADN”, la famosa molécula que contiene nuestra información genética. En una nota previa sobre el Día del ARN, Tosar explicaba que “la cadena ADN-ARN-proteínas forma lo que se llama ‘el dogma central de la biología molecular’. Necesitás esas tres cosas para que haya vida celular”. Como el ARN participa en el proceso que lleva la información del ADN a la expresión de la proteína correspondiente, al principio se le había asignado sólo ese papel de intermediario. Pero el panorama era más complejo: al ARN mensajero (ARNm), que es ese intermediario, se fueron agregando otros ARN, como el de transferencia (ARNt), que es el que sintetiza la proteína, los ARN ribosomales (ARNr) y los ARN cortos, que no habían sido descubiertos por la ciencia hasta el año 2000. Y el ARN no sólo está dentro de la célula: se encontró que hay ARN en vesículas extracelulares, fuera de las células, e incluso fuera de las vesículas extracelulares o exosomas (palabra que significa, justamente, “cuerpos externos”). Con este repaso, ahora entra Tosar, que nos recibió en su laboratorio de la Facultad de Ciencias.

“No fuimos ni por asomo los primeros en encontrar ARN extracelular fuera de las vesículas, pero posiblemente sí hayamos sido de los primeros que pusimos el foco de la investigación en ese ARN extravesicular”, cuenta. Tosar sostiene que la investigación se centraba en el ARN de las vesículas “porque a priori se entendía que el ARN que estaba fuera de esas vesículas era destruido muy rápidamente, por lo que la chance de que pudiera llegar a otra célula y tener algún tipo de interacción iba a ser muy baja”. Pero no es haciendo lo que hacen todos que uno se hace un lugar en la ciencia.

“En mi tesis doctoral, que hice desde la Udelar en el Laboratorio de Genómica Funcional del Institut Pasteur, que es dirigido por mi orientador de tesis, Alfonso Cayota, hicimos un estudio en líneas celulares sobre el ARN que está dentro de vesículas extracelulares y fuera, y nos llamó la atención que la mayor parte estaba fuera”. Y de ese ARN que estaba fuera de las vesículas, la inmensa mayoría eran fragmentos de mitades de ARN de transferencia”, recuerda. “El grupo de Cayota fue de los primeros en reportar la presencia de muchos fragmentos de ese ARN de transferencia en un organismo unicelular patógeno. Hoy, diez años después, sabemos que esos ARN son muy importantes y regulan muchos procesos, algo que al principio no estaba del todo claro” agrega.

Tosar y el grupo vieron que algo raro estaba pasando, porque en la visión aceptada de la biología la molécula del ARN es una molécula inestable, que no debería andar paseando sola sin la protección de las membranas celulares o las vesículas. “El ARN es una molécula muy inestable, que dura muy poco tiempo porque hay unas enzimas, llamadas ARNasas, que están por todas partes, que lo degradan muy rápidamente”, sostiene Tosar, entonces había algo que no le cerraba “Si el ARN era tan inestable, y si bien las vesículas extracelulares le confieren un entorno que lo protege de la degradación, ¿por qué mucha gente, y nosotros también, ve que la mayor parte de ese ARN extracelular está fuera de las vesículas?”. Así que Tosar decidió confiar en su instinto.

“Empezamos a tirar de la piolita para entender ese problema. La pregunta era bien concreta: ¿cómo puede haber tantos fragmentos de ARN de transferencia en el medio extracelular, cuando uno esperaría que se degrade rápidamente?”. También buscaron con qué proteína se asociaba ese ARN de trasferencia, porque “con la cabeza de que el ARN no puede sobrevivir por sí solo si no está dentro de vesículas extracelulares, tenía que estar formando un complejo con una proteína”, explica. “Después de casi un año de experimentos que no arrojaban resultados claros, no dábamos con esa proteína candidata”, dice, y señala la importancia de los experimentos, que desbarrancan todo lo que pensás. “Ese es el experimento que hay que hacer, el que te demuestra que estás equivocado, porque te hacen preguntarte qué otra explicación hay”. Y había otra.

“A veces me preguntan a qué enfermedad se podría relacionar lo que estudiamos, y yo contesto que a todas, porque estamos estudiando la célula, cómo funciona y cómo interactúa con otras células”. Juan Pablo Tosar.

Vieron que no hacía falta ninguna proteína, sino que el ARN de transferencia, que se presenta en un único hilo de aminoácidos, podría ser más estable si formara una cadena doble, lo que ellos llaman un “dúplex”. “Eso cambiaba un poco el panorama, porque el ARN que se degrada es el ARN de cadena simple, el que tiene un único hilo, pero si está formando un dúplex ya es ARN de cadena doble, y eso es mucho más resistente. Y esos dúplex se forman por la propia secuencia del ARN, que funcionan un poco como si fueran las cremalleras de un cierre: si las secuencias son complementarias, eso se cierra; lo mismo pasa con el ADN”.

En este entonces estaba en nuestro país Erik Westhoff, invitado a dar un seminario por Ricardo Ehrlich y Mónica Marin. “Es una eminencia en el campo de la estructura del ARN”, dice Tosar. Luego del seminario le llevaron su idea del dúplex de ARN. “Pensé que no nos iba a prestar mucha atención, pero al otro día llegó con una hoja. Se había pasado toda la noche en el hotel dibujando cómo podría darse ese dúplex”. Con ese espaldarazo y evidencia de laboratorio, en 2018 publicaron un artículo mostrando que esos fragmentos de ARN de transferencia forman dúplex.

“Ahí teníamos una explicación completamente distinta a cómo nosotros, y creo que toda la comunidad internacional, veníamos pensando el ARN extracelular. Todos pensábamos que si algo es muy abundante afuera de la célula es porque de alguna manera la célula lo libera mucho. Pero empezamos a cuestionar eso. De repente esta molécula, como forma esos dúplex, es súper resistente, pero en realidad la célula está liberando mucho más ARN que el que somos capaces de detectar. Efectivamente, la mayor parte de ese ARN se degrada, y lo que estamos viendo son los Terminator del ARN, esos que no logra degradar nadie y que, por tanto, se acumulan”. Ya sólo por este trabajo, la investigación de Cayota, Tosar y sus colegas es valiosa. “Era una idea un poco atrevida, porque estábamos sugiriendo que no estamos entendiendo casi nada de lo que es el ARN extracelular. Lo que veíamos eran los restos de una batalla, pero nos estábamos perdiendo la batalla”.

Inhibir al inhibidor

Si las células estaban liberando más ARN que el que se podía ver, porque se degradaba rápidamente, había que encontrar una manera de evitar que eso sucediera. Y allí, como bien narra la nota de Nature y Tosar explica con orgullo, el error fue parte de la solución.

“El paso siguiente fue agregar una enzima que inhibiera la enzima que destruye al ARN, es decir, evitar que el ARN se degradara y entonces ver realmente qué hay en al medio extracelular”, podría explicar Tosar sin faltar a la verdad. Pero la idea de inhibir la enzima surgió luego de ver qué pasaba cuando en lugar de enfriar sus muestras a los 4 ºC que indicaba el protocolo, Tosar, pensando que no cambiarían mucho los resultados, dejaba que las muestras alcanzaran los 7 °C.

“La anécdota es bastante tal cual. En este caso la periodista como que indagó bastante hasta encontrarla, pero anécdotas de este tipo son cosa de todos los días. Creo que la mayor parte de los microdescubrimientos que hacemos, porque son micros al principio, y después se van agrandando, vienen por casualidad o errores. Son pocas las veces que uno se imagina determinada hipótesis, va y la demuestra”, dice, no por humildad sino por convencimiento. “Yo diría que eso es más la norma que la excepción. En este caso comenté con Cayota y mis compañeros que cuando largaba la centrifugaciones a 7 °C en lugar de a 4 °C había un pequeño pico relacionado con el ARN que no veía. En cambio, cuando las enfriaba lo suficiente, ese pico se hacía un poco más grande. La diferencia era minúscula, y si no fuera minúscula a otra gente del mundo le hubiera llamado la atención. No era algo muy llamativo, pero había algo que variaba con la temperatura”.

Fue entonces cuando pensó que lo que estaba pasando era que el ARN se estaba degradando, algo que la baja temperatura evitaba. “Nos preguntamos qué pasaría si además de frío, le dábamos una ayuda de afuera y colocábamos un inhibidor de RNAsa, la enzima que degrada al ARN”, cuenta. Cuando Fabiana Gámabaro, estudiante de maestría, realizó el experimento con ese lineamiento y los picos de ARN resultaron enormes. Como enorme sería también lo que descubrirían gracias a ello.

Pero antes detengámonos en este detalle no menor: esta idea de poner inhibidores de la enzima hoy se puede usar en cualquier laboratorio del mundo que quiera estudiar el ARN extracelular. “Sí, creo que eso se va a asentar como un protocolo de rigor de ahora en adelante”, reconoce.

Viendo lo que nunca nadie había observado antes

Partimos definiendo el ARN. Luego vimos que había ARN fuera de las células y cómo Tosar y sus colegas notaron la forma en que ese ARN podría no degradarse estando fuera de las vesículas protectoras. Recién acabamos de presenciar cómo se las ingeniaron para ver no sólo el ARN extracelular no vesicular resistente a la degradación, sino también todo el ARN que las células expelen. Inhibiendo la enzima que degrada el ARN podrían ver todo el ARN que hay allí afuera. Y entonces, Tosar y los suyos hicieron otro gran descubrimiento que podría cambiar algunas ideas de la biología.

“Al evitar la degradación empezaron a surgir muchas sorpresas. Lo que en un momento era algo acotado a unas moléculas específicas de ARNt, de golpe nos permitió ver de todo, observamos moléculas de todo tipo, color y tamaño”, recuerda con alegría. “Empezamos a encontrar ARN de transferencia pero no fragmentos, sino enteros, y ARN ribosomal, que es el que forma parte de los ribosomas”. Y así, como quien no quiere la cosa, se adentraron donde nadie había llegado antes. “Había reportes de ARN ribosomal en vesículas extracelulares, pero no por fuera de ellas. Había algunos indicios de fragmentos, incluso de nuestro equipo, pero creo que fuimos los primeros en encontrar ARN ribosomales enteros por fuera de las vesículas extracelulares. Eso ya era como irse un poco de mambo”, dice Tosar.

“Cuando Suárez hace un gol con la camiseta de Uruguay no digo ‘qué contento debe estar Suárez’, soy yo también el que está jugando ese partido. De alguna manera hay que trabajar para que todos nos sintamos parte del trabajo que los científicos hacemos en los laboratorios, de los pequeños y no tan pequeños aportes que vamos haciendo, de los goles, por llamarlos de alguna manera”. Juan Pablo Tosar.

Se fueron de mambo, sí. Pero les gustó y no tenían ganas de parar. “Luego nos preguntamos si ese ARN ribosomal tenía también las proteínas”. Para tratar de contestar esto, realizó una pasantía en Estados Unidos, en cuyos laboratorios redobló la apuesta: “Eso nos permitió decir que tenemos ribosomas completos en el medio extracelular”.

Él lo dice como al pasar, pero es mucho. Encontrar ribosomas fuera de la célula es como encontrar ojos en el estómago, no en el sentido de que lo que propongo sea posible, sino en el sentido de que es algo que el conocimiento actual no nos permitía pensar. Por eso Tosar y las investigaciones del grupo en el que trabaja fueron elegidos para la nota en Nature.

Pero si hay algo de lo que uno se da cuenta escuchando a Tosar, es que la curiosidad no tiene límites. O al menos la suya. Así que uno le pregunta y él responde: “Lo que viene después es tratar de entender qué consecuencias puede tener esto. Se abren un montón de posibilidades. Una puede ser que los ribosomas extracelulares no tienen ningún efecto ni hacen nada, que simplemente están ahí porque vienen de células que se murieron y explotaron y su destino último es degradarse. Eso hay que aceptarlo como una hipótesis”, dice. Sin embargo, no parece ser el caso: “Tenemos ya algunos resultados, preliminares pero interesantes, en colaboración con Mercedes Segovia y Marcelo Hill, de la Facultad de Medicina y el Institut Pasteur, que muestran que desde el punto de vista inmunológico estos ribosomas extracelulares no serían moléculas inertes, sino que serían reconocidos por células del sistema inmune”. Eso abre un abanico de posibilidades para cuestiones terapéuticas.

“Hoy día, con lo que sabemos, lo más probable es que estos ribosomas lleguen al medio extracelular debido a células que se están muriendo y están liberando sus componentes”, dice Tosar. Eso no implica que el descubrimiento sea menos interesante. “Tal vez no es el tipo de respuestas que la comunidad científica internacional, e incluso yo, buscaba, es decir, moléculas que las células activamente liberan al medio extracelular para que vayan a otra célula y pasen un mensaje, como si la célula tuviera una voluntad de transmitir un mensaje a otra célula”, reconoce Juan Pablo.

“Lo que vemos hoy nos habla de que cuando se muere una célula, está liberando sus componentes intracelulares. Y una de las funciones fundamentales del sistema inmune no sólo es protegernos de los agentes patógenos que nos atacan desde el mundo exterior, sino también ir haciendo una vigilancia de cómo está el cuerpo”. En ese contexto, los ribosomas y el ARN extracelular podrían informarle al sistema inmune que está pasando algo. “El sistema inmune reacciona y decide si lo que hay que hacer es reparar tejido roto o si, en el caso de una infección, hay que combatirla. Entonces, es muy importante para el sistema inmunológico detectar moléculas que normalmente deberían estar dentro de la célula y que ahora aparecen fuera”, puntualiza. “Esa es como una avenida de trabajo que se abre, que consiste en estudiar la inmunología de estos ARN”.

Pero no es la única. También se abre otro camino: “Hay otra vía mucho más ambiciosa, y es la posibilidad de que los ribosomas extracelulares estén funcionando como ribosomas”. Eso implicaría que podría haber una producción de proteínas por fuera de la célula, y ahí sí el paradigma sería desafiado en mayor medida.

“Si se pudiera describir que en el espacio entre dos células determinadas pueda haber una concentración alta de ribosomas, de ARN de transferencia, de ARN mensajero y de ATP suficiente para que haya síntesis, tal vez no de proteínas, pero al menos sí de péptidos, de pedazos de proteína, eso podría tener implicancias enormes”, reflexiona Tosar. “Y eso es lo que este artículo en Nature de alguna forma reconoce, que nuestro trabajo abre la puerta a por lo menos atreverse a considerar la posibilidad”.

Le digo que si fuera una película, encontraron a todos los actores en el mismo set. “Los personajes están ahí, y es como si nosotros les hubiéramos puesto un GPS a Leonardo DiCaprio, Brad Pitt y Denzel Washington. Desde el espacio vemos que están todos juntos. Capaz que están filmando una película, o capaz que se juntaron a hacer un asado”. Sólo llegar a ese lugar en el que podamos entender qué están haciendo allí es lo fascinante que tiene esa construcción colectiva de conocimiento, ese relato escrito a múltiples manos que hemos dado en llamar ciencia y que, sin escalas ni restricciones, nos lleva de Malvín Norte a Nature.

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