Prueba superada: bacteria de insumos de queso artesanal avanza en su camino como potencial probiótico para ayudar en la depresión

Hace nueve años, productores de queso semiduro artesanal de los departamentos de Colonia y San José buscaban resolver un problema productivo: los sueros de leche que utilizan para elaborarlos, una especie de sopa que tiene distintos microorganismos que le confieren el sabor y aroma particular a cada queso, presentaban una cierta variabilidad que implicaba que no siempre obtenían los quesos con las características que se proponían.

Para tratar de abordar esa problemática, en 2015 la Facultad de Veterinaria de la Universidad de la República, el Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE) y la cooperativa de laboratorios veterinarios Colaveco presentaron un proyecto ante el Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca para caracterizar genómicamente los microorganismos presentes en el suero de leche con el que fermentaban los quesos –en particular de las bacterias lactobacilos– para así transitar luego hacia fermentos más estandarizados o predecibles. El proyecto anduvo y se generó conocimiento para hacer mejores quesos. Pero no sólo eso.

A los microbiólogos del IIBCE se les ocurrió buscar si algunos de estos lactobacilos, que como resisten a procesos de alta acidez durante la elaboración del queso podrían ser potenciales candidatos a sobrevivir en el estómago, producían algunas sustancias de interés a la hora de pensar en probióticos.

¿Qué son los probióticos? Podríamos definirlos como organismos vivos –en este caso, bacterias– que cuando se consumen proporcionan beneficios para la salud. Y bingo: como contamos en una nota de 2022, el equipo de investigadoras e investigadores dio con varias cepas que producían ácido gamma-aminobutírico, GABA para los amigos, un importante neurotransmisor que tiene un efecto ya reportado en la ansiedad y la depresión. ¿Pero cómo es que una bacteria que va a parar a los intestinos puede tener algo que ver con la ansiedad y la depresión, trastornos asociados al cerebro y el sistema nervioso?

Justamente, el descubrimiento de un eje intestino-cerebro, una vía de comunicación en ambos sentidos en la que la microbiota intestinal, es decir, la comunidad de microorganismos que viven en ese órgano, juega un rol importante, es una de las áreas más agitadas y efervescentes de la ciencia de las últimas décadas. Si una bacteria libera sustancias que pueden repercutir en el cerebro, el sistema nervioso y el comportamiento, podríamos decir que son probióticos que mejoran la salud mental, es decir, psicobióticos.

El equipo de investigadores entonces dio con 44 cepas de lactobacilos aisladas del suero de quesos artesanales que tenían la capacidad de producir GABA. Todas fueron puestas a prueba para ver si además podrían resistir un medio ácido como el del tracto digestivo, así como sus sales biliares, y si se adherían al mucus intestinal, lo que habla de la chance de permanecer en el intestino y no ser rápidamente expulsadas. 19 cepas del género Lactiplantibacillus pasaron las pruebas con nota.

“Cuando vimos esta propiedad, enseguida nos despertó la idea de investigar su capacidad de liberar GABA y ver su asociación con el comportamiento de los animales. Eso no está en este paper, sino que es el siguiente trabajo que publicaremos y que surge tras el estudio desarrollado en el marco de la maestría de Joaquín”, nos contaba Cecilia Scorza, investigadora del IIBCE hace dos años. “Cuando publiquen sus resultados seguro haremos otra nota”, agregaba yo allí. Pues bien, la espera terminó.

Publicado con el título “Efecto beneficioso de la cepa LPB145 de Lactiplantibacillus productora de GABA aislada de iniciadores de queso evaluado en comportamientos similares a la ansiedad y la depresión en ratas”, el trabajo lleva la firma de Joaquín Lozano, Sofía Fernández, Claudia Piccini y Pablo Zunino, del Departamento de Microbiología del IIBCE, y de Sara Fabius, Jessika Urbanavicius y la ya mencionada Cecilia Scorza, todas del Departamento de Neurofarmacología Experimental del mismo centro de investigación.

Tras leer el trabajo y ver que la cepa LPB145 salió bien parada de las pruebas, salimos disparados hacia el Clemente Estable para volver a conversar de bacterias, microbiota, ansiedad y depresión con Joaquín Lozano, Pablo Zunino, Sara Fabius y Cecilia Scorza.

Eligiendo la indicada

En el trabajo anterior, tras realizar pruebas in vitro, se habían quedado con casi 20 cepas de Lactiplantibacillus productoras de GABA como buenas candidatas para protagonizar más investigación de calidad. ¿Por qué decantarse para este trabajo sólo con una?

“Había varias que podían ser candidatas para esta etapa experimental in vivo, pero había que optar por una porque no nos daba el tiempo ni los recursos para probar más de una”, dice Pablo Zunino recordándonos de un plumazo que si bien estamos ante ciencia que se ubica en la frontera del conocimiento, también estamos en el país en que todos hablan de apoyar la ciencia, pero a la hora de poner los mangos desaparecen más rápido que microbiota tras administración de antibióticos por un período prolongado.

“Había un empate técnico entre cuatro cepas que eran bastante parecidas, pero la 145 sintetizaba un poquito más de GABA. Como nuestra hipótesis original era que GABA era el que iba a generar los cambios comportamentales, si íbamos a ir por una sola cepa, la que producía más GABA nos pareció la más indicada”, redondea Joaquín Lozano.

“Una vez que decidimos eso, nos unimos al equipo de Neurofarmacología Experimental, que dirige Cecilia, donde me junté con Sara, que tiene un montón de experiencia en el área de neurociencias, de estudios comportamentales y de manejo en el bioterio”, dice Joaquín. El bioterio es donde están los animales de experimentación, en este caso, ratas Wistar. “Nos pasamos días y días haciendo ensayos”, agrega.

“Desde el momento en que ellos identificaron estas bacterias con esta capacidad liberadora de GABA, como nuestro objetivo en general es buscar estrategias terapéuticas innovadoras que mejoren o complementen a las actuales, o que reduzcan sus efectos secundarios no deseados, buscamos ver si al ser liberadoras de GABA había aquí algo a explorar para modificar la ansiedad o que tuviera un efecto similar al de un antidepresivo. Y así comenzamos esta etapa comportamental”, explica Cecilia Scorza.

“La pregunta entonces ahora era mecanística: nos propusimos investigar si esa capacidad de las bacterias de sintetizar GABA podría estar modificando el comportamiento de animales en tres modelos, muy sencillos pero muy significativos, que permiten acercarse a conductas asociadas a la ansiedad y la depresión”, agrega.

La microbiología y las neurociencias se reunían entonces en torno a la prometedora bacteria LPB145 empujada por este eje microbiota-intestino-cerebro. Y para ello, había que complementarse.

Cruce de saberes

Joaquín viene del mundo de la microbiología, por lo que si bien trabajar con bacterias está bajo su radar, las pruebas comportamentales con roedores no formaban parte de su mundo cotidiano. A Sara Fabius, que trabaja en neurofarmacología, le pasa lo contrario: modelos comportamentales y drogas son parte de su día a día como investigadora de maestría, pero recurrir a bacterias que, vivas, actúan en un ecosistema dinámico y comunitario como es la microbiota intestinal no era lo suyo.

“Con Sara vivimos todo un cambio de paradigma”, reconoce risueño Joaquín. “Al igual que yo, ella para su maestría también tuvo un proyecto que relacionaba microbiota y comportamiento, entonces intercambiamos mucho, ella aprendiendo de microbiología y de análisis bioinformático, y yo aprendiendo a trabajar en el bioterio y teniendo que estudiar comportamiento de ratas”, sostiene. Sara agrega que cada ensayo implicó cuatro días de entrenamiento más 28 días de tratamiento. “Para este trabajo además hicimos tres rondas de cuatro ratas de cada uno de los dos grupos experimentales, totalizando 24. A la mitad se les administró la bacteria liofilizada por vía oral y a la otra mitad, el grupo de control, no”, detalla Sara.

“Con Sara estamos acostumbradas a trabajar con fármacos, por lo que trabajar con bacterias fue un cambio importante”, enfatiza Cecilia. “Los fármacos tienen una acción directa, sus receptores están expresados en general en el sistema nervioso, y generan efectos ansiolíticos o antidepresivos determinados. Pero en este caso estamos hablando de bacterias que tienen su sitio de acción primario en el intestino”, agrega sobre este cruce de disciplinas obligado por cómo suceden las cosas en nuestros cuerpos. “Este abordaje además nos cambia totalmente la perspectiva de patologías de salud mental asociadas exclusivamente al cerebro, ya que esto nos implica movernos de órgano, dado que el sitio de acción es otro no solamente distinto, sino distante del cerebro”, agrega.

“Eso es lo maravilloso de esta línea de investigación que compartimos entre nosotros y que comparten muchos investigadores alrededor del mundo. Todos estamos tratando de entender esa conexión entre intestino y cerebro, y cómo las bacterias son capaces de modificar comportamientos que están asociados en este caso a patologías de salud mental”, sostiene Cecilia.

Por eso en este trabajo no sólo vieron los efectos del potencial probiótico de esta cepa en tres pruebas comportamentales con ratas, sino que además se propusieron evaluar “el impacto del tratamiento con la cepa LPB145 en la estructura y diversidad de la microbiota intestinal”, de forma de poder “discernir un posible mecanismo de acción del tratamiento con LPB145 a través del eje microbiota-intestino-cerebro”. Eso implicó bastante tiempo más que el que pasaron en el bioterio. “Nosotros en microbiología siempre hacemos todo por triplicado, así que eso también implica trabajo y tiempo”, sostiene Joaquín.

Pero hagamos como ellos y vayamos por partes. Primero veamos los efectos en los test comportamentales, y luego veamos qué pasó en la microbiota de los animales.

Tres modelos

“Hay una serie de pruebas en animales que nos permiten evaluar algunos aspectos comportamentales que se asemejan a algunos síntomas que tienen las personas que padecen distintos desórdenes. En este caso a nosotros nos interesaban los desórdenes de ansiedad y trastornos del tipo depresivo porque ya se había reportado un efecto de GABA en ellos”, explica Cecilia.

Las tres pruebas que realizaron con las 24 ratas de laboratorio fueron el test de campo abierto, el de laberinto en cruz elevado y el de nado forzado. Como aclara Cecilia, aquí la idea no es hacer de cuenta que los animales padecen depresión o ansiedad, sino “mediante test medir aspectos que se asemejan a algunos síntomas”.

“Por ejemplo, en el caso de la depresión, lo que el modelo evalúa es la capacidad que tiene el animal de soportar una situación estresante. Para el caso de la ansiedad, que nosotros llamamos estrictamente 'ansiedad experimental', medimos la capacidad que tiene el animal de sobrellevar o enfrentarse a algunos factores que le generan miedo”, explica Cecilia.

Los test que utilizaron aquí están detallados en la literatura científica y han sido usados en gran cantidad de investigaciones. Incluso los modelos están validados aplicando fármacos que se sabe que producen efectos antidepresivos, como la fluoxetina o la sertralina, o ansiolíticos. “Si el animal es capaz de sobrellevar ese miedo o ese estrés bajo los efectos de una droga ansiolítica o antidepresiva, la validación del modelo está correcta y nosotros podemos evaluar otro tipo de sustancias con esos mismos modelos”, cuenta Cecilia.

“Dado que estos ensayos parten de la base de observar cómo se mueve el animal, qué actividad tiene en cada uno de los test, son muy dependientes de su actividad. Si lo que les administramos los lleva a tener hiperactividad o hipoactividad, eso afectaría los resultados”, detalla Joaquín. “Para evitar eso, primero hicimos el test de campo abierto para ver si este tratamiento altera la actividad de la rata”, agrega.

En el test de campo abierto, tanto las ratas del grupo de control que se alimentaron con leche proporcionada en una jeringa como aquellas del grupo en el que la leche además tenía bacterias de la cepa LPB145 liofilizadas, se colocan en una arena de 45x45 cm con paredes transparentes de 40 cm de alto. Una cámara cenital registra todos los movimientos de las ratas.

“Si en el test de campo abierto ves que la actividad locomotora del animal se altera, y por ejemplo que no se mueve porque está sedado, luego no podés decir que en las otras pruebas una mayor o menor cantidad de movimientos indican que al animal el suministro de la bacteria le bajó la ansiedad o tuvo efectos antidepresivos. No podrías jamás llegar a esa conclusión si el animal literalmente no exploró el modelo por tener movimientos restringidos o los exploró en demasía por tener movimientos exacerbados”, explica Sara.

“Con ese test lo que hacemos es descartar falsos positivos o falsos negativos, de manera de estudiar específicamente lo que el modelo te permite concluir”, redondea Cecilia. En otras palabras, en este test de campo abierto, las ratas del grupo de control como las tratadas con bacterias liberadoras de GABA tendrían que comportarse igual para que lo observado en los otros dos test fuera relevante. Los otros dos modelos fueron el conocido como laberinto en cruz elevado y el de nado forzado.

El laberinto en cruz elevado, como dice el trabajo, “se utiliza para medir comportamientos similares a los de ansiedad en roedores”. Consiste en dos brazos de 50x10 cm, uno abierto y otro con paredes, a unos 50 cm del suelo que, como dice el nombre, se cruzan. Una mayor exploración o tiempo en los brazos abiertos en el grupo bajo tratamiento en comparación con el grupo de control estaría asociada a un efecto ansiolítico, así como una reducción en esos comportamientos como un efecto ansiogénico.

Por su parte, el test de nado forzado es “útil para predecir la actividad antidepresiva de nuevos fármacos o para detectar comportamientos que se asemejan a síntomas de la depresión en roedores”. Las ratas se colocan en un recipiente cilíndrico de 50 cm de alto y 20 de diámetro que contiene agua en una cantidad tal que permite “que los animales naden o floten sin tocar el fondo del tanque con sus patas”. Las ratas, además, no pueden escalar para salir, de allí lo de “forzado”. Los experimentadores registran los comportamientos y, como dice el trabajo, “una disminución del tiempo que el animal está inmóvil y/o un aumento del tiempo en conductas activas (nadar o escalar) se asocia con un efecto antidepresivo del tratamiento”, ya que eso es lo que se ha visto en animales a los que se les administró antidepresivos conocidos.

¿Cómo les fue en los tres test que se les aplicaron a las ratas tras recibir durante 28 días el probiótico con la cepa nativa de lactobacilos aislada del cuajo de queso artesanal o el placebo?

Afectando la ansiedad... de los investigadores

En el trabajo reportan que en el test de campo abierto no hubo diferencias entre las ratas de ambos grupos, lo que indica que “no hubo cambios en la locomoción en respuesta al tratamiento bacteriano oral”. Luz verde entonces para ver qué pasaba en las otras dos pruebas.

En el laberinto elevado tampoco hubo diferencias significativas entre ambos grupos. ¡Pucha! La administración de la cepa LPB145, en las cantidades y plazos del trabajo, no parecería funcionar como probiótico con efecto benéfico en la ansiedad.

Les pregunto qué tanto afectó la ansiedad de ellos, que en las pruebas de ansiedad no pasara nada. “La verdad que la afectó mucho, porque justamente el GABA está mucho más relacionado con el trastorno de ansiedad que con el de depresión”, confiesa Joaquín.

“Si bien cambios de niveles de GABA están relacionados con la depresión, en realidad las benzodiazepinas, que son los fármacos que se utilizan para la ansiedad, funcionan por el mecanismo dependiente de GABA. Entonces uno tendería a que pensar que si estas bacterias producen GABA, veríamos un efecto por ese lado”, lo respalda Sara.

¿Hubieran visto algo de haber usado cantidades mayores de estas bacterias en cada ingesta diaria? ¿Y si la hubieran administrado más cantidad de días? Todas esas cosas rondan seguramente en sus cabezas... pero para que cuajen en afirmaciones basadas en evidencia, tenemos que darles más tiempo (y posibilidades para que sigan investigando). Ahora vayamos a la otra prueba.

A no deprimirse: pasando la prueba

En el test de nado forzado las cosas fueron distintas. “La cepa LPB145 no indujo cambios significativos en los comportamientos activos (natación y escalado) en comparación con el grupo de control”, reportan para luego decir que “en cambio, se observó una disminución significativa del tiempo de inmovilidad en las ratas tratadas con LPB145 en comparación con el grupo de control”.

Las ratas a las que les habían dado estas bacterias no se rendían tan rápido a la desesperanza de no poder salir de esa situación incómoda, ya que, como dice el artículo, “en esta prueba la inmovilidad indica que los animales experimentan un estado conductual agudo incapaz de hacer frente al estrés inducido por la exposición al estímulo inevitable de natación forzada”. ¡Bingo!

“Sí, ese fue el principal efecto que encontramos en este test que mide lo que se llama la desesperanza aprendida”, comenta Joaquín.

“Un día antes de realizar la medición del comportamiento en esa prueba, todas las ratas pasan por una sesión previa en el tanque de agua en las que se las deja por 15 minutos. Ahí aprenden que no tienen escapatoria, que no lograrán salir. Es importante que el animal aprenda dicha tarea para que al día siguiente, en los cinco minutos en los que vamos a estar cuantificando todos sus comportamientos, podamos ver la reacción frente a un estrés del que la rata sabe que no puede escapar”, señala.

“El efecto que se vio en el test en animales que habían recibido esta bacteria es lo que se esperaría ver si se les hubiera administrado un antidepresivo como los que se usan en la clínica con pacientes”, explica Sara. “Ese efecto antidepresivo sería lo que esperarías ver si al animal le hubieras dado, por ejemplo, una droga clásica como la fluoxetina”, agrega.

“Nuestros resultados apoyan la idea de que la ingesta de esta cepa podría ejercer efectos beneficiosos para controlar los síntomas depresivos”, dicen en el artículo. Festejen, uruguayos, festejen: ¡la LPB145 había dado otro paso en su –largo– camino para convertirse en un psicobiótico con efecto en la depresión!

“Es importante destacar que no es que estemos diciendo que estas bacterias vayan a curar una depresión. Estos son resultados muy prometedores que ayudan a entender o encontrar un mecanismo a través de las bacterias que modifican el comportamiento asociado a la depresión”, enmarca Cecilia.

“Para nosotros es un camino innovador para colaborar cuando los fármacos no logran responder a todas las necesidades que tiene la gente”, prosigue Cecilia. “Hay muchas personas que tienen resistencia a los tratamientos antidepresivos o ansiolíticos, hay efectos secundarios no deseados, interacciones farmacológicas. Este abordaje desde la microbiota abre todo un capítulo de una estrategia muy interesante e innovadora y que, desde nuestro punto de vista, es sumamente interesante explorar”, agrega. Y uno –y calculo que ustedes también– no puede menos que concordar mientras siente que le nacen unas ganas locas de aplaudir a todo el equipo.

Efecto en la microbiota

Al administrar la bacteria productora de GABA LPB145 podrían pasar varias cosas que explicaran los efectos observados en el modelo animal de depresión. Por ejemplo, podría aumentar la cantidad de estas bacterias en la microbiota, podría alterarse la estructura y diversidad de los distintos microorganismos que la componen, o cosas así. En el trabajo detallan lo que pasó en ese sentido.

Para empezar, reportan que no encontraron mayores cantidades de Lactiplantibacillus en las heces de las ratas bajo tratamiento que en las del grupo de control al final del tratamiento.

“Que no encontráramos a nuestra bacteria en mayores cantidades puede deberse a varios factores, entre ellos su propia naturaleza”, señala Joaquín aludiendo a que en el trabajo anterior, si bien vieron que tenía capacidad de adherirse al mucus intestinal, tampoco era que se aferraba con alma y vida. “Tiene un perfil de adherencia un poco bajo, lo que nos hace pensar que es bastante transitoria, que ejerce su efecto y se va”, dice. Pero también agrega que, por el esquema de trabajo, tomaron y analizaron las fecas al inicio del experimento, el día 1, al terminar el entrenamiento, el día 4, y luego al final del tratamiento, el día 32. “Que no la hayamos visto el día 32 no significa que no esté allí”, afirma, además, confirmando la máxima de que ausencia de evidencia no es evidencia de ausencia.

“De hecho es un resultado que vimos en varios estudios, incluso en otras especies animales y en otros tipos de trabajos realizados por nosotros mismos. Al administrar probióticos y analizar la microbiota, no veíamos que tuviéramos enriquecida la bacteria que nosotros le dábamos al animal como potencial probiótico”, agrega Pablo. “Allí hay distintas lecturas, y que esa presencia sea transitoria puede implicar algo que no necesariamente es malo”, sostiene. ¡Claro! No cambiar la composición de la microbiota con cada probiótico puede ser algo bueno, porque como ya ha quedado demostrado varias veces, no siempre está bueno cambiar.

“Nosotros proponemos que una de las maneras en que esta bacteria ejerce su función es influyendo sobre el ambiente, y eso a su vez va regulando una serie de cosas que tienen que ver más con el aspecto funcional de toda la microbiota”, complementa Pablo.

Siguiendo con lo que encontraron, reportan que tampoco encontraron grandes cambios en la estructura o la diversidad general de la microbiota de las ratas de ambos grupos. Sin embargo, al analizar más en detalle los géneros presentes –mediante el análisis de las Variantes de Secuencia de Amplicones– vieron sí algunos cambios.

“Muchas Variantes de Secuencia de Amplicones pertenecientes a los géneros Bifidobacterium, Alistipes, Fusicatenibacter y Roseburia aumentaron significativamente su abundancia relativa en el grupo tratado”, sostiene la publicación.

Como detallan en el trabajo, estos géneros de bacterias que aumentaron en la literatura también estaban reportados en mayor abundancia en pacientes o animales a los que se les administraban antidepresivos o que tenían efectos benéficos relacionados con el eje intestino-cerebro. “Las bacterias que aumentaron no fueron bacterias aleatorias, sino que son bacterias de géneros que justo tenían características ya asociadas a efectos beneficiosos respecto de ansiedad o depresión. Eso para nosotros fue un punto grande”, sostiene Joaquín.

Una bacteria que sigue en carrera

En estos casi diez años desde que comenzó el proyecto para caracterizar los microorganismos presentes en cuajo para elaborar quesos, las bacterias que aisló el equipo han dado varios pasos que apuntan a su potencial uso como probiótico para la salud mental. Pero claro, se necesita seguir investigando.

“Ahora lo que hicimos fue secuenciar el genoma de esta bacteria LPB145 y estamos en pleno análisis. La idea es ver qué potencialidad tiene con respecto a posibles mecanismos probióticos, así como para ver si tiene genes vinculados a cosas que pueden no estar buenas, por ejemplo, a determinadas resistencias a antibióticos, o algún otro tipo de genes de virulencia”, dice Pablo.

“Lo que venimos viendo es que no tiene resistencia a antibióticos ni mecanismos de virulencia”, dice Joaquín para tranquilizarnos de que nuestra amiga sigue en carrera.

“En el laboratorio estamos poniendo a punto otro modelo de ansiedad, así que sería interesante probar cómo le va ahí”, lanza Sara. “Hay que usar otros modelos para evaluar sus efectos. Yo usaría otra dosis también; subir la dosis es bien de la farmacología, o aumentar el tiempo en el que se administra”, agrega Cecilia. Las ideas bullen.

“Incluso un camino a explorar sería el de poder utilizar esta bacteria para potenciar los efectos de antidepresivos que se utilizan en la clínica. Allí se abren un sinfín de posibilidades para investigar”, dice Cecilia. “Todo eso se puede modelar en animales y hacer experimentos en animales utilizando bacterias y antidepresivos clásicos para ver si se potencia el efecto o si se acelera, porque uno de los principales problemas que tienen los antidepresivos es que demoran entre 15 y 20 días en hacer efecto. Tal vez las bacterias ayudan a mejorar el efecto antidepresivo y que aparezca antes. Todo eso son experimentos que se pueden hacer”, agrega.

El maravilloso trabajo del equipo del IIBCE, que une microbiología y neurociencias, hace que la bacteria LPB145 siga adelante con su prometedora carrera como futuro probiótico o psicobiótico. Es posible que en el camino se encuentre con reveses y contratiempos, pues en ciencia los resultados nunca están asegurados. Lo que sí es claro es que sin ciencia vibrante como esta, los resultados podemos esperarlos sentados. ¿Verdad que vale la pena apoyarla con un poco más que discursos bonitos?

Artículo: Beneficial effect of GABA-producing Lactiplantibacillus strain LPB145 isolated from cheese starters evaluated in anxiety and depression-like behaviours in rats
Publicación: Beneficial Microbes (junio de 2024)
Autores: Joaquín Lozano, Sara Fabius, Sofía Fernández, Jessika Urbanavicius, Claudia Piccini, Cecilia Scorza y Pablo Zunino.